Oncotype DX Breast Recurrence Score

Tecnologia Subjacente

O processo do teste Oncotype DX®

Por trata-se de um teste de diagnóstico de múltiplos genes, o Oncotype DX fornece as bases para um plano de tratamento individualizado. Através de uma avaliação quantitativa da probabilidade do benefício da quimioterapia e recorrência à distância, o teste pode aumentar a confiabilidade do médico na decisão do tratamento, visto que o plano de tratamento é personalizado para cada paciente.

O teste Oncotype DX é realizado no laboratório Genomic Health®, onde o teste foi desenvolvido. Primeiro, o RNA é extraído do espécime de tumor de câncer de mama e purificado. A seguir, o RNA é analisado com o uso de uma técnica chamada de RT-PCR – “Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction” ou, em português, Reação em Cadeia da Polimerase Via Transcriptase. Finalmente, os valores do Recurrence Score® é calculado a partir dos resultados da expressão gênica.

Vantagens da RT-PCR

O Oncotype DX analisa a expressão de 21 genes de um espécime de tumor com o uso de uma técnica chamada de RT-PCR. O método RT-PCR em tempo real, de alto rendimento, foi desenvolvido para analisar a expressão dos genes selecionados simultaneamente. É sensível, específico, altamente reproduzível e tem uma faixa dinâmica ampla. A RT-PCR é uma tecnologia madura que é utilizada rotineiramente em várias aplicações clínicas, incluindo o teste de carga viral para o vírus HIV.

Para quantificar a expressão genética, o RNA é extraído do tecido do tumor embebido em parafina e fixado por formalina (FPET) e submetido ao tratamento de DNase I. O teor de RNA total é medido e a ausência da contaminação de DNA é verificada. A transcrição reversa é feita e é seguida por reações de RT-PCR de TaqMan® quantitativas (Roche Molecular Systems, Inc.) em placas com 384 cavidades. A expressão de cada um dos 16 genes é medida de forma triplicada e, então, normalizada em relação a um conjunto de cinco genes de referência.

Os métodos de teste padronizados do teste Oncotype DX foram aperfeiçoados para minimizar a variabilidade
devido a:

  • Método de preparação de tecidos: FPET versus recém-congelado
  • Idade do bloco tumoral, armazenamento e variabilidade na preparação
  • Heterogeneidade dentro e entre os blocos de FPET
  • Heterogeneidade em relação ao tumor enriquecido e áreas sem tumor dentro de um bloco de FPET
Desenvolvimento do teste Oncotype DX

O teste Oncotype DX foi desenvolvido em quatro etapas. Cada uma dessas etapas é detalhada abaixo.

  1. Aperfeiçoamento de métodos para quantificar a expressão gênica em tecido embebido em parafina e fixado em formalina (FPET)
  2. Seleção de 250 genes candidatos a partir do genoma humano
  3. Teste dos genes candidatos para identificar a melhor lista de genes para a
    validação clínica
  4. Validação clínica prospectiva de 21 genes e cálculo de resultado do Recurrence Score
Etapa 1. Otimização dos métodos para quantificar a expressão gênica em tecido embebido em parafina e fixado em formalina

A capacidade de trabalhar com amostras de FPET é crucial, já que esse é o método padrão para armazenamento e conservação de tumor em muitos países. Quando o tecido é conservado em parafina, o RNA é fragmentado. Entretanto, a razão relativa do RNA entre os genes permanece inalterada. Através da utilização de técnicas de RT-PCR, a expressão da maioria dos genes—em relação a um conjunto de genes de referência–pode ser medida. Para desenvolver o teste Oncotype DX, os pesquisadores da Genomic Health aperfeiçoaram a tecnologia de RT-PCR: 1) para quantificação em tempo real e alto rendimento do RNA específico em FPET e 2) para poder ser reproduzida independente da variabilidade inerente nos blocos tumorais.

Etapa 2. Seleção de 250 genes candidatos a partir do genoma humano

Os pesquisadores da Genomic Health contaram com várias fontes para identificar os 250 genes candidatos—aqueles possivelmente associados ao comportamento do tumor cancerígeno mamário—dentre aproximadamente os 25.000 genes do genoma humano.

ODX Breast

Etapa 3. Teste dos genes candidatos para identificar a melhor lista de genes para a
validação clínica

Os 250 genes candidatos foram analisados em um total de 447 pacientes de três estudos clínicos independentes a fim de identificar uma lista de genes fortemente correlacionados à sobrevida livre de recorrência à distância. A seleção dos 16 genes tumorais usados para o teste Oncotype DX foi feita com base nos resultados dos três estudos clínicos, que demonstraram significância estatística entre esses genes e a recorrência de câncer de mama à distância. Cinco genes de referência foram identificados para normalizar a expressão desses genes relacionados ao câncer. Além disso, esses estudos serviram de base para o cálculo do resultado do Recurrence Score, que combina os dados de expressão gênica dos 21 genes em um único resultado.

Etapa 4. Validação clínica prospectiva de 21 genes e cálculo do Recurrence Score

Os 21 genes do teste Oncotype DX e o cálculo do Recurrence Score foram ratificados em um estudo clínico independente, de grande repercussão, multi-institucional (Estudo NSABP B-14) e em um estudo de controle de caso com base em uma extensa população de pacientes com câncer de mama pela empresa Northern California Kaiser Permanente. Os critérios finais e o plano de análise foram definidos prospectivamente. Os resultados desses estudos foram incluídos na sessão "Best of Oncology" na reunião da ASCO de 2004 e os resultados do estudo de Validação Clínica B-14 da NSABP foram publicados no The New England Journal of Medicine (30 de dezembro de 2004).

Lista de 21 Genes Usada para Calcular o Resultado do Recurrence Score

A lista dos genes do teste Oncotype DX foi selecionada a partir de experimentos baseados em arranjos de DNA realizados em tecido fresco congelado. O algoritmo de resultado do Recurrence Score foi derivado de 3 estudos de pacientes de câncer de mama e, então, foi validado clinicamente em múltiplos estudos independentes.

  • O resultado do Recurrence Score é calculado a partir da expressão de 16 genes relacionados ao câncer e 5 genes de referência usados para normalizar a expressão daqueles genes
  • Nos estudos clínicos, os 16 genes relacionados ao câncer demonstraram uma ligação estatística coerente
    com a recorrência do câncer de mama à distância, bem como poder preditivo em relação ao benefício
    da quimioterapia

Lista de 21 Genes Usada para Calcular o Recurrence Score:
16 genes relacionados ao câncer e
5 genes de referência a partir de
3 estudos

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